采用鸡胚EF评估扩张型心肌病患者自身抑制性抗体的研究
摘要：目的 使用心脏超声对鸡胚心脏EF测定评估扩张型心肌病心力衰竭患者是否存在自身心肌抑制性抗体。方法 随机选取36例扩张型心肌病心衰患者和23例冠心病心衰患者的IgG血清，滴入18天胚龄的鸡胚中，用M超检测鸡胚心肌抑制状况。结果 冠心病心衰组EF为81.03±2.67％，扩心病心衰组13例EF为81.24±2.33％，23例EF为62.04±2.98％（p＜0.05），扩张型心肌病患者存在心肌抑制抗体的阳性率为63.9％。结论 扩张型心肌病心衰中63.9％患者可能存在心肌抑制性抗体。
关键词：鸡胚 心脏超声 扩张型心肌病 心力衰竭 心肌抑制性抗体
Abstract：Objective To establish the method- ultrasonic echocardiography (UCG) testing left ventricular ejection fraction (LVEF) of chick embryos to evaluate cardiodepressant autoantibodies in patients with dilated cardiomyopathy(DCM) and heart failure(HF). Methods 36 cases with DCM patients with HF(DCM group) and 23 cases of coronary heart disease patients with HF(non-DCM group) were included. Cardiodepressant antibodies were determined by UCG of 18 day old chick embryos after adding the patients’ purified immunoglobulin G.. Results EF of non-DCM group is 81.03±2.67％,and it of DCM group is 81.24±2.33％. EF is 62.04±2.98％ in 23 cases of DCM group. Conclusion Cardiodepressant antibodies were found in 63.9％ of 36 patients with DCM and had no relation to other clinical parameters.
Keywords: chick embryo ultrasonic echocardiography dilated cardiomyopathy heart failure cardiodepressant autoantibody
扩张型心肌病是一种以左心室或双心室舒张及收缩功能障碍为特征的原发性心肌病。目前虽有β受体阻滞剂、ACEI、ARB或心室再同步疗法可缓解部分患者的症状，但多数患者最终因心力衰竭而死亡。近年来扩张型心肌病心衰的原因被认为与自身免疫反应有关，针对其发病机制的免疫吸附疗法正在受到关注。但重要的是必须首先确定哪些患者体内存在心肌抑制性抗体。本研究试图使用心脏超声对鸡胚心脏EF测定来评估患者体内是否存在心肌抑制性抗体。
1.资料与方法
1.1研究人群
本研究入选了36例扩张型心肌病患者和23例冠心病心力衰竭的住院患者。扩张型心肌病的诊断按照2008年WHO/ISFC的标准，冠心病心力衰竭患者均曾经行冠状动脉造影诊断冠心病明确。在样本入选时，所有患者均有心力衰竭症状，NY心功能分级Ⅲ~Ⅳ级，用心脏彩超双平面改良Simpson法确定LVEF＜45％者。
1.2方法
1.2.1血清IgG提纯
所有入选对象均被抽取3ml的血清保存于-80℃冰箱内。当标本备齐后，取冰冻血清温水解冻，应用中科晨宇生物科技提供的抗体纯化试剂盒来提纯血清IgG，步骤如下：①将抗血清低温15000g离心5分钟，最上层有漂浮物，最下层有沉淀，取中间层；②振荡悬匀Protein A Sepharose 4 EF；③加190-200μl（50％）Protein A Sepharose 4 EF悬液到小离心柱，应去掉Tip的尖端；④加500μl相应的平衡缓冲液到小离心柱，800g离心1分钟；⑤将稀释的样品加入小离心柱，加盖，翻转混匀Protein A Sepharose与样品，重复翻转5分钟，以使Protein A Sepharose与样品充分结合，500g离心1分钟；⑥加500μl相应的平衡缓冲液到小离心柱， 800g离心1分钟；⑦加400μl相应的洗脱缓冲液，800g离心5分钟；⑧为保持抗体活性，洗脱品立刻加入20μl中和缓冲液。将收集的IgG液测定其蛋白含量、活性和纯度，确定每份血清标本的IgG含量至少为1mg，然后低温保存备用。
1.2.2判断心肌抑制性抗体的鸡胚试验
取孵化18胚龄的海兰白胚蛋（慈溪市益大禽业有限公司）做心脏彩超，首先在鸡胚卵圆空气囊端打个小洞（直径约2mm），滴入麻醉剂10min后将患者血清提纯的IgG（或生理盐水）加入卵圆空气囊（1.0mg/egg）。20min后，在卵圆空气囊区用小血管钳仔细剥去空气囊端的蛋壳，超声探头从此洞探测鸡胚的心脏搏动（超声仪型号：GE Vivid 7-12L，探头频率：13MHz）。用M超来重复测定左心室舒张期内径（LVDd）、左心室收缩期内径（LVDs）、左心室缩短分数（FS）、左室射血分数（LVEF）及心率（HR）（至少测3次取平均值）。本研究将鸡胚随机分为生理盐水组（n=39）、扩心组（DCM组，n=36）及冠心病心衰组（non-DCM组，n=23）。non-DCM组研究对象的年龄、性别、LVEF值均与DCM组相匹配。首先确定生理盐水组鸡胚的LVEF均数±SD，存在心肌抑制性抗体定义为LVEF低于均数-2SD。预实验显示，IgG未被细胞因子或神经体液因子，包括IL-6、TNF-α、去甲肾上腺素或尿钠肽所污染。
1.4扩张型心肌病心肌抑制性抗体阳性病人的临床特征
心肌抑制性抗体阳性和阴性两组病人的年龄、性别、LVEF及pro-BNP两组间差异无统计学意义（见表1）（p＞0.05）。LVEF和pro-BNP均在抽血测自身心肌抗体的一周内测定的。
表1 两组扩张型心肌病心衰患者的临床特征
两组间比较p均＞0.05。
1.5统计学分析
计量资料用均数±标准差（ ±S）表示。两组之间的均数比较用独立t检验。多组之间的均数比较采用方差分析（F检验），经F检验有统计学意义，再进一步行多重比较，本研究采用Dunnett-t检验。计数资料的比较用x2检验。p＜0.05有统计学意义。
2.结果
经多组均数之间的方差分析提示LVDD在各组之间差别无统计学意义（F=1.58，p >0.05），而LVDS、LVEF、LVFS及HR在各组间差异有统计学意义（F值分别为3.10、3.81、3.76、3.21，p >0.05），本研究进行了各组均数之间的多重比较（Dunnett-t检验），结果提示，较之生理盐水组，Non-DCM组以及DCM-组中各数据差异并无统计学意义，而DCM+组中，LVDD与生理盐水组差异无统计学意义，但LVDS、HR均显著高于生理盐水组，LVEF、LVFS均显著低于生理盐水组。各组鸡胚心脏超声的测定值见表2、图1。
表2 各组鸡胚心脏彩超的测定值（ ±S）
注： DCM+组的LVDS、HR显著高于生理盐水组，而LVEF、LVFS小于生理盐水组（*p＜0.05，**p＜0.01）。
图1 各组鸡胚心脏超声的EF及FS值
图2 a：生理盐水组鸡胚的心脏彩超，其中LVEF=84.42％；b：DCM+组鸡胚的心脏彩超，其中LVEF=28.93％
3.讨论
扩张型心肌病的病因尚未完全阐明，可能是以遗传基因为基础，由病毒感染诱发的自身免疫性疾病，最终可导致严重心力衰竭。目前认为部分扩张型心肌病与自身免疫有关，患者体内的体液免疫异常可能起了重要的作用。许多证据表明患者血清中存在抗心肌抗体，这类抗体多数为β受体抗体和M2受体抗体[1-3]，清除这种心肌抑制性抗体，可能改善心功能。基于这种认识，一系列免疫相关疗法已试用于临床，例如免疫吸附疗法、血浆置换疗法、免疫抑制疗法等等[4-5]。
其中免疫吸附治疗是目前免疫治疗中最主要的形式。然而并非所有扩张型心肌病患者均适合做免疫吸附治疗[6]，只有治疗前心肌抑制性抗体阳性的患者采用该疗法有效，反之疗效不佳，因此选择哪种扩张型心肌病患者对于做免疫吸附治疗疗效至关重要。扩心患者是否存在心肌抑制性自身抗体，在临床上无法判定[7]。即使用培养心肌细胞的测定也不能作为免疫吸附治疗的筛选方法，仅仅是因为重症患者就使用免疫吸附疗法的话，治疗无效的病例将会增加。日本在世界上首先建立简便有效的体外实验[,5]。他们将患者血清加入加入鸡受精卵后用心脏超声测定鸡左室射血分数，若存在心肌抑制性自身抗体，则左室射血分数下降。104例扩张型心肌病的测定结果表明65.9％病例存在心肌抑制性自身抗体[5]。
我们用心脏超声测得的生理盐水对照组LVEF值均数±2SD作为正常范围，发现冠心病心衰组不存在心肌抑制性抗体，对鸡胚心脏EF无抑制作用，与生理盐水对照组相同。而36例扩张型心肌病心衰患者中有23例（63.9％）患者血清IgG对鸡胚心脏EF有抑制作用的，明显低于生理盐水组和冠心病心衰组（p＜0.01），与日本报告的相似。提示这些患者可能通过吸附体内的心肌抑制性抗体，减少其对心肌的免疫损伤，使心功能获得改善。而在本研究中扩张型心肌病的心衰患者是否存在心肌抑制性抗体，无论在年龄、性别和心力衰竭的严重程度上，两组差别均无统计学意义。
本研究还发现心肌抑制抗体阳性的扩张型心肌病组鸡胚的心率也明显高于心肌抗体阴性组，提示该抗体除了对心肌收缩功能有明显影响外，对鸡胚心脏的β受体也有作用，但不能排除心室率增快与心脏射血分数降低有关。
本研究选择18天龄的鸡胚来用作检测是否存在抗心肌抗体。首先是因为心肌抑制性抗体属于IgG类抗体，可以透过鸡胚卵圆空气囊的半透膜进入鸡胚的血液循环，抑制鸡胚心脏的收缩功能。其二是由于18天龄的鸡胚各个脏器已经发育成熟，心脏的舒缩在超声下清晰可见，时间过早鸡胚尚未成熟，鸡胚心脏难以测定，过晚鸡胚开始破壳进行肺呼吸而影响心脏超声检测。此外，鸡胚来源充足，价格低廉，鸡胚心脏抑制实验操作简单，无需特殊设备或条件，而且重复性好。
鸡胚心脏抑制试验可用作免疫吸附治疗前确定扩张型心肌病患者是否存在心肌抑制性自身抗体的筛选方法，也可作为免疫吸附治疗后心肌抑制性抗体是否转阴的简便易行方法。
参考文献
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