哮喘小鼠骨髓树突状细胞表型及共刺激分子
探讨哮喘小鼠骨髓来源树突状细胞（DCs）的表型及共刺激分子在哮喘发病中的影响。方法 用卵清蛋白建立哮喘模型，利用rmGM?CSF和rmIL-4体外诱导骨髓细胞分化为DCs，流式细胞仪检测DCs表面共刺激分子的表达，混合淋巴细胞反应检测DCs刺激同种异体的T淋巴细胞增殖的能力。结果 在两种细胞因子的作用下，从骨髓中可以诱导出大量的DCs；且均表达DCs的表面标志(33D1)。哮喘组DCs表达CD86分子的水平高于对照组，而CD40、CD80在两组之间没有差异；哮喘组与对照组DCs均能强烈刺激同种异体T淋巴细胞的增殖，哮喘组DCs的刺激能力明显强于对照组。结论 哮喘组DCs的抗原递呈能力增强，表明DCs在哮喘的发病中可能起着重要作用。
【关键词】 哮喘；树突状细胞；B7；CD40；混合淋巴细胞反应
The
哮喘是一种以嗜酸性细胞(Eos)、T淋巴细胞和肥大细胞浸润、气道破坏及气道高反应(AHR)为特点，并且有多种炎性介质参与作用的慢性气道炎症性疾病。活化的CD4+T细胞（Th2）是主要的效应细胞。越来越多的研究提示共刺激分子B7.1(CD80)与B7.2（CD86）等在免疫反应中起重要作用［1，2］。树突状细胞（dendritic cells，DCs）是功能最强的专职抗原递呈细胞（antigen-presenting cells，APCs），是目前发现的唯一能在体外直接激活初始T细胞的APCs，因此DCs成为研究APCs与T细胞相互作用的桥梁和焦点。本研究旨在探讨哮喘小鼠骨髓树突状细胞表面分子的表达及其对淋巴细胞的刺激作用。
1 材料与方法
1.1 动物 BALB/C小鼠，4～6周，雄性，购自中国科学院上海实验动物中心。ICR小鼠，6~8周，雄性，购自江苏省实验动物中心。
1.2 细胞因子与抗体 重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）和重组小鼠白细胞介素-4（rmIL-4）（R＆D system）；FITC anti?Mouse CD86、FITC anti?Mouse CD80、FITC anti?Mouse CD40及Anti?Mouse DC Marker 33D1（eBioscience）；FITC Goat anti?Rat IgG（H+L）（北京中山生物公司）。
1.3 主要试剂 卵清蛋白（OVA，GradeⅡ）（Sigma）；RPMI1640培养基(含L-谷氨酸，不含NaHCO3)（GIBCO）；胎牛血清(FCS)（Hyclone）；丝裂霉素C（Kaowa Hakko Kogyo）；伴刀豆球蛋白(ConA)（Sigma）；CellTiter 96?AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay(MTS)（Promega）。其他试剂为国产分析纯。
1.4 方法
1.4.1 小鼠哮喘模型的建立 参照文献［3］。20只小鼠随机分为两组，每组10只，在第1、8天腹腔注射OVA混悬液0.1ml［含OVA 10mg，Al(OH)3 20mg］，14天后以1%OVA超声雾化（S-888E型超声雾化器）吸入，每次30min，持续2周，直至出现呼吸急促，腹肌抽搐，烦躁不安等症状，为哮喘的阳性反应。正常对照组不做任何干预处理，正常饲养。
1.4.2 骨髓DCs的分离培养 参照文献方法［4］，略有改动。拉颈处死BALB/C小鼠，无菌剥离股骨和胫骨。用Hank’s液冲出骨髓细胞。收集骨髓细胞悬液，用0.83%Tris-NH4Cl溶液裂解红细胞，加入完全培养液终止裂解。调细胞浓度为1×106/ml。接种于24孔培养板，每孔1ml。37℃，5%CO2的孵箱中培养，4h后轻轻摇动培养板，连同培养液一起弃去未贴壁的细胞，并加入含rmGM?CSF（1000u/ml）和rmIL-4（500u/ml）的完全培养液继续培养。第3天弃去培养液和大部分悬浮的细胞，并补足细胞因子；隔日半量换液；第7天，用吸管轻轻吹打收集所有的悬浮细胞，即为体外培养扩增的小鼠骨髓来源的树突状细胞。
1.4.3 形态学观察 每日用相差显微镜观察细胞的生长和形态变化。
1.4.4 DCs表面分子的检测 收集培养至第7天的DCs，调细胞浓度为2×105/ml，分别加入1μl FITC标记的大鼠抗小鼠的CD86、CD80、CD40单克隆抗体和大鼠抗小鼠的DCs特异性标志——33D1，设立空白对照，4℃避光反应30min。在加入DCs特异性标志33D1的管中再加入2μl FITC标记的山羊抗大鼠IgG(H+L)，4℃避光反应30min。上流式细胞仪检测。
1.4.5 同种异体的混合淋巴细胞反应 将收集的DCs用完全培养液悬浮，加入终浓度为25μg/ml的丝裂霉素C，置37℃，5%CO2孵箱。调细胞浓度为4×104/100μl、2×104/100μl、1×104/100μl、4×103/100μl，加入96孔板，每个浓度3复孔。每孔再加入经尼龙毛柱分离的ICR小鼠的脾脏T细胞2×105/100μl，终体积为200μl。并设立ConA阳性对照、T细胞对照及空白对照。37℃，5%CO2孵箱继续培养96h。在培养结束前4h每孔加入20μl MTS溶液，继续培养4h。培养结束后用酶标仪读490nm时的吸光值，并计算刺激指数（SI）。SI=（实验组OD值-空白对照组OD值）/（T细胞对照组OD值-空白对照组OD值），结果以3孔均值表示。
1.5 统计学方法 结果以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS10.0软件进行两样本组间的t检验，以P＜0.05表示有统计学意义。
2 结果
2.1 骨髓DCs的体外培养生长 在rmGM-CSF和rmIL-4的诱导下，培养的第2天可以看到绝大多数细胞贴壁生长，出现点状的细胞集落，第3天轻轻摇动除去未贴壁的细胞并继续培养2天，可见细胞集落明显增多﹑增大（图1～3）。再继续培养可见细胞体积明显增大且形态不规则，有3～8个不等的突起，呈现特征性的星状、树突状，并且逐渐由贴壁变为悬浮，至第7天，细胞多悬浮但也有些稍微贴壁，但轻轻吹打即可脱壁，以此来收集细胞。在倒置显微镜下可以看到哮喘鼠骨髓来源的DC和对照组骨髓来源的DC均有大小不一的树突，但在镜下看不出二者树突数目有明显的差别。
2.2 流式细胞检测结果 FACS分析显示在哮喘鼠和正常对照鼠骨髓来源的DCs分子表面均有DC分化相关抗原CD80、CD40、CD86及小鼠DC特异的表面标志33D1的表达，如图4所示。但CD86分子的表达明显比正常对照鼠增高（51.60±8.73和36.11±3.51，P＜0.05），而其他CD分子在两组之间差异无显著性，如表1和图5所示。哮喘小鼠及正常对照小鼠骨髓DC都表达33D1分子，虽然表达不很高（由于IL-4的加入降低了它们的表达），但仍能证明培养出来的就是DCs。
图1 哮喘小鼠骨髓DC培养至第2天的细胞集落
图2 哮喘小鼠骨髓DC培养至第4天的细胞集落
图3 哮喘小鼠骨髓DC培养至第7天的细胞
表1 哮喘模型鼠与正常对照鼠DC表面共刺激分子表达的百分数 （x±s，%）
注：n=3（3复孔的均数），与对照组相比，*P＜0.05
022、043、027、024为哮喘组DC017、038、037、019为对照组DC
图5 哮喘组和对照组DC表型比较
2.3 两组DC刺激同种异体T细胞增殖能力的分析 结果显示哮喘组DC和对照组DC均能刺激同种异体的T细胞的强烈增殖，且随DC数目的增多而增强；而且哮喘小鼠DC比对照小鼠DC刺激同种异体的T淋巴细胞增殖的能力明显增强，表明哮喘小鼠DC有更强的抗原递呈能力，如表2和图6所示。对同一组小鼠不同DC浓度刺激T淋巴细胞增殖能力比较发现，同在哮喘小鼠中不同DC浓度刺激T细胞增殖的能力也不同，如图7所示。而在对照小鼠中，不同浓度的DC刺激T细胞增殖的能力没有明显差异性（P＞0.05）。
表2 哮喘组和对照组DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力的比较 （x±s）
注：n=3，与对照组相比，☆P＜0.001，△P＜0.01，*P＜0.05
图6 不同DC数目刺激同种异体T细胞增殖的比较
图7 在哮喘组中不同浓度DC刺激T淋巴细胞增殖的比较
注：※P＜0.01，*P＜0.05
3 讨论
DC在体内的含量很少，在血液中仅占单个核细胞总数的0.5%～1.0%，且表面缺乏特征性标志，难以与其他细胞分离纯化，因此，直接从外周血或脾脏中分离不仅操作复杂，而且细胞得率很低，很难满足实验中的大量需要。体外诱导扩增DCs的方法很多。自从Inaba［5］用rmGM-CSF体外诱导扩增小鼠骨髓DC以来，人们逐步建立并完善了多种培养扩增DC的方法。如从脐带血、外周血干细胞、外周血单核细胞中诱导分化出DC。尽管不同的前体细胞扩增DC的方法各不相同，但GM-CSF是必不可少的。GM-CSF可以诱导DC前体增殖分化，并可在体外维持DC的存活。IL-4往往与GM-CSF同时使用，特别是从外周血单核细胞诱导DC时，IL-4可抑制巨噬细胞增生，而有利于向DC分化。但DC的鉴定没有特异的分子标志，若鉴定所得细胞为DC，往往根据形态学、组合型标志和混合淋巴反应刺激同种异体的T细胞增殖这3个方面来判断。除了具有许多树突样的突起这一典型的特征外，其表面还高表达MHCⅡ类分子、共刺激分子和黏附分子如CD40、CD86、CD80、ICAM等；能迁移至引流淋巴结刺激初始T细胞的活化增殖，具有这些特征的细胞方能称之为DC［6］。目前，有一些DC特异的表面标志已经得到公认［7］，如小鼠表面的33D1和NLDC145，大鼠的OX62及人DC表面的CD1a和CD83。本研究获得的细胞在显微镜下呈现大小不一的树突，而且流式细胞分析也检测到了小鼠DC特异的表面标志——33D1和DC相关的分化抗原：CD40、CD80、CD86；最后我们发现所诱导扩增的两组小鼠DC可以强烈刺激同种异体的T淋巴细胞的增殖，并且随着刺激细胞数目的增多而增强。因而，从这3个方面我们可以认定所培养出来的细胞正是DCs。
DC提供了抗原特异T细胞活化、增殖的两个信号。DC在肺表面和气道上皮形成强大的防御网络，可以识别、加工、处理和递呈吸入的抗原，提供抗原信号，形成抗原肽-MHC复合物向引流淋巴结迁移，在迁移过程中，DC表达上调表面共刺激分子CD40、CD86、CD80等，这些分子可以与T细胞表面的CD28结合，形成CD80/CD86-CD28共刺激信号通路，提供了抗原特异的T细胞活化所必需的第二信号，从而启动了初始T细胞的活化。因此认为气道DC在诱导初始型T细胞对吸入抗原的初次免疫反应和过敏反应中起重要作用，是始动气道变态反应之必需［8］。
目前已经知道哮喘的效应细胞是CD4+T细胞，特别是Th2细胞。DC是唯一能激活初始型T细胞的抗原递呈细胞，并使其向Th2细胞分化的过程中起重要作用［9］。通过表面共刺激分子的表达来启动Th细胞活化并影响其向Th2细胞的分化和功能。当共刺激信号缺乏时，会导致T细胞反应无能。CD80/CD86-CD28信号通路与过敏性哮喘中的关系已在一些实验中得到证实。研究发现，T细胞表面分子CD80、CD86的配体CD28缺乏时，气道内DC不能诱导Th2反应［10］。阻断CD80/CD86与配体CD28的相互作用，可抑制Th2类细胞因子基因的表达［11］。在小鼠气道炎症模型中减轻小鼠的气道炎症，降低支气管灌洗液中嗜酸粒细胞数量及IL-5、IL-4的含量［12］。在哮喘患者支气管灌洗液中发现，T细胞的活化增殖和IL-5产生依赖于CD86［13］。这些都表明CD86在哮喘发生中的重要作用，依赖于CD86启动初始T细胞的活化，并且诱导Th细胞向Th2细胞分化，促进IL-5的产生，诱发Eos增多的气道炎症。本研究中，哮喘小鼠骨髓DC表达CD86分子水平较对照鼠有明显升高（P＜0.05），进一步证实了DC可以通过其表面的共刺激分子CD86影响Th2细胞分化。CD80主要诱导Th1分化，但对Th2分化也有一定的影响，对抗原所致的炎症有维持和增强作用。Cheng等［11］用OVA致敏BALB/C小鼠建立哮喘模型研究脾脏来源的DC的表型发现，哮喘组CD80的表达明显上调，而CD86则没有差异。但在本实验中却未见CD80在两组小鼠DC中有差异，表明了DC的异质性，不同来源DC可能存在功能上的差异，也提示可能在哮喘的不同阶段，CD86和CD80起着不同的作用。DC表面的CD40可以和T细胞表面的CD40L结合，促进T细胞自身的活化，导致IL-12的产生，而IL-12则可以促进Th1细胞的分化。本研究结果提示，CD40在两组中并未见差异，这值得进一步探讨。
混合淋巴细胞反应即T淋巴细胞的活化增殖反应。这种现象的存在是由于MHC抗原有很强的免疫原性，无论是Ⅰ类还是Ⅱ类抗原，都能在体外直接诱导出强烈的初次T淋巴细胞免疫应答。DC对T淋巴细胞作用的强度与其表面共刺激分子的表达有关。共刺激分子的表达越高，对T细胞的刺激能力越强［14］。本实验结果显示，哮喘小鼠DC和对照组小鼠DC均能诱导同种异体的T淋巴细胞增殖，且随DC数目的增多增殖能力增强。哮喘小鼠DC刺激T细胞增殖明显高于对照组小鼠，表明哮喘小鼠DC的抗原递呈能力明显强于对照组。在哮喘小鼠中随DC数量的增加增殖能力也明显增强，表明DC数量存在差异时，其功能也存在差异，数量多则功能强，数量少则功能弱。
本研究发现，哮喘小鼠骨髓DC表面CD86分子表达增加的同时，其刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力也明显增强，表明了哮喘小鼠DC可能通过其表面刺激分子CD86的差异表达，从而增强了抗原递呈能力，导致了T细胞的过度活化，特别是向Th2细胞的活化，导致气道炎症。但DC在诱导Th细胞分化过程中可能受许多因素的影响，DC诱导哮喘炎症的机制值得进一步研究。
【参考文献】
1 Cheng X，Wang C，Qian G，et al. CD80，but no94.
12 陈萍，张云志，赵海涛，等.阻断CD28-CD86共刺激途径抑制哮喘小鼠气道炎症的研究.中华内科学杂志，2003，42：805-806.
13 Mark Larche，Douglas S，Robinson，et al. The role of T lymphocytes in the pathogenesis of asthma. J Allergy Clin Immunol，2003，111:450-460.
14 王黎明，陈珊珊，刘艳荣，等.慢性髓性白血病来源的树突状细胞的功能研究.中国实验血液杂志，2000，8：161-163.
#p#分页标题#e#
参考文献：
